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gga-let-7a-5p通过靶向GDF6调节鸡骨髓间充质干细胞多向分化

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  • 用途: 硕士毕业论文 Master Thesis
  • 作者:上海论文网
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  • 论文字数:44145
  • 论文编号:el2021122221411127577
  • 日期:2021-12-22
  • 来源:上海论文网

医学论文哪里有?本试验的目的是分离和培养具有多向分化潜能的鸡 BMSCs,探究 gga-let-7a-5p 靶向 GDF6 对 BMSCs 多向分化的调控作用,为 gga-let-7a-5p 调控 BMSCs 在再生医学上的应用和疾病治疗提供实验基础与参考依据。


第一章 文献综述


1.1 骨髓间充质干细胞

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)第一次成功分离是从骨髓中,作为多种细胞的前体,该细胞具有增殖和分化成多系谱细胞的潜能。在特定条件下可分化成不同类型的细胞,如:骨骼、脂肪、肌肉、神经等其他细胞。MSC 具有分化为谱系特异性组织类型的能力[1, 2]、其归巢潜力[3]和组织修复潜力[4]等特性引起了人们对 MSC 基础生物学机制的研究和临床治疗的利用。目前已从小鼠、大鼠、人、狗、猪、绵羊、山羊、兔子、猫等多个物种中分离了 MSCs。MSCs 存在于脐带血、脂肪组织、肌肉组织以及骨髓组织中,其中 BMSC 具有易分离、易获得、易培养和低免疫原性等特点,成为目前研究最为广泛和最具应用价值的一类干细胞。

鸡作为最常见集约化养殖的一类经济动物,为人类带来经济收入的同时也提供了人体所需的营养;作为已完成基因组完全测序的物种,使转基因鸡的产生成为可能,产生生长速度快、食用品质佳、抗病虫能力强、可产生药用蛋白等多功能新品种鸡;鸡胚可用作卵生动物胚胎学研究的优选模型等,这些优点使其成为研究热点。关于研究鸡 BMSCs 的报道目前很少,其中鸡 BMSCs 多功能干性的研究更是稀少,更多是关于哺乳动物 BMSCs 的研究。对鸡 BMSCs 分离培养的是 He 等人在 1993 年从鸡胚胎骨髓获得并开展的,随后国内外的实验室从不同日龄的鸡胚或鸡中以及不同组织中分离培养得到 BMSCs。要从骨髓里分离得到 BMSC 需要将非 BMSC 细胞除去,其中包含红细胞,造血干细胞等。常见的细胞纯化方式会导致细胞毒性、BMSC 功能变化和导致 BMSC 大量损失等[5]。然而,从鸡的骨髓中分离出 BMSC 的报告很少,由于骨髓中其他细胞类型较少,极大降低了鸡 BMSCs 分离纯化的难度,BMSCs 分离纯化需要克服的难点是血细胞和造血干细胞的混入。众多技术被各个实验室用来净化或丰富从骨髓中分离出来的 BMSC,其中包括优先附着培养塑料、密度梯度离心[6]、使用滤器过滤血细胞、抗体细胞分类[7, 8]、低密度和高密度培养技术[9]、以及频繁的更换培养基[10]。

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第 2 章 鸡 BMSC 分离培养及其多能性鉴定


2.1 前言

BMSCs 广泛存在于骨髓等组织中,其中骨髓中的 BMSCs 最为丰富且其他杂细胞含量少,是最易分离纯化的 BMSCs 的组织来源。现存在多种多样的方法纯化 BMSCs,其中密度梯度离心法、差速离心法都在一定程度上损伤 BMSCs,全骨髓血液贴壁培养法在最大程度上保留细胞的增殖活性和分化能力并能减少分离培养物中造血细胞污染的机会[119]。家禽的 BMSCs 与其他物种的 BMSCs 一样将表达 MSC 的细胞表面标志物CD44、CD29 和 CD34 等。

BMSCs 能具有多系谱分化的能力,已有报道证明鸡 BMSCs 在一定条件下转化为成骨、脂肪、肌肉细胞[120]。细胞在分化时不仅细胞外观产生变化而且转代谢产物也发生改变。当 BMSCs 分化为成骨细胞时,细胞不断发生钙盐沉积形成钙结节,且表达成骨细胞的标志基因 RUNX2、COL1A1、BGLAP 和 BMP2 等。当 BMSCs 向脂肪细胞分化时,细胞内大量脂肪累计形成脂滴,同时表达脂肪细胞标志基因 PPARG、FABP4、CEBPA 和 CEBPB 等[121]。虽然其他物种的 BMSCs 向肌肉细胞和神经细胞分化已有报道[122],但是鸡 BMSCs 向肌肉细胞和神经细胞分化还未见报道。

本实验旨在利用全骨髓贴壁法技术,控制首次更换培养液时间与胰酶消化时间来分离、培养、纯化 BMSCs,建立一种有效的 BMSCs 体外培养体系;经过检测 BMSCs集落形成能力、细胞表面标志物等试验验证 BMSCs 生物学特性;通过定向诱导为成骨、脂肪、肌肉、神经细胞试验,以及相应标志基因检测,证明笔者获得的 BMSCs 具有多向分化能力。

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第三章 gga-let-7a-5p 对 BMSC 多向分化能力的影响


3.1 前言

MicroRNA 参与许多生理过程并对其产生重要调节作用,包括发育、寿命、分化、信号通路、细胞凋亡和代谢等。MiRNA 在细胞核内合成,在细胞质中成熟,绝大多数miRNA 都是与靶基因的 3’UTR 发生特异性结合来抑制靶基因发挥其复杂的调控功能。由于 miRNA 广泛的调控作用成为了大家的研究热点。已有实验证明 miRNA let-7 家族对干细胞的分化发挥着重要的调控作用,其中邓振汉证明 let-7f 促进大鼠神经干细胞分化[125]、陈庚阳证明 let-7f-5p 促进 BMSCs 向成骨分化[126。但是目前还未有文献报道某一个 miRNA 对 BMSCs 的多向分化存在调控作用。gga-let-7a-5p 也是 Let-7 家族的一员,根据前人实验分析得知 gga-let-7a-5p 在鸡胚胎发育时期表达量发生显著变化且发挥着重要的调控作用。这引发了我们的兴趣,上一章我们研究了 BMSCs 的多向分化潜能,具有分化为成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、神经细胞的能力。gga-let-7a-5p 是否能对鸡的 BMSCs 的多向分化发挥调控作用,需要加以验证。

首先进行 miRNA 的靶基因预测,再探究在 BMSCs 发生多向分化时 gga-let-7a-5p的表达量是否会随之发生变化。我们对 BMSCs 的每种分化设置成四组实验,分别为gga-let-7a-5p mimics、mimic NC、gga-let-7a-5p inhibitor、inhibitor NC 组。通过转染试剂将 miRNA 转入四组细胞,在分别进行四种诱导,通过茜素红、油红 O 染色实验、荧光定量 PCR 实验探究不同 miRNA 处理组之间 BMSCs 向成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、神经细胞分化的差异。通过以上实验说明 gga-let-7a-5p 对 BMSCs 多向分化的调控作用。为进一步利用 gga-let-7a-5p 调控 BMSCs 治疗鸡的疾病提供实验基础与参考依据。



3.2 实验材料

3.2.1 实验试剂

试剂名称 品牌/货号或产品编号

Cell-Light Apollo 567 Stain Kit(EDU) RIBOBIO/C10371-1

Bulge-Loop miRNA qRT-PCR Starter Kit RIBOBIO/C10211-1

Bulge-Loop U6 qPCR Primer Set RIBOBIO/ MQPS0000002-1-100

Bulge-Loop miRNA qRT-PCR Primer Set RIBOBIO/ MQPSCM001-1

gga-let-7a-5p mimics RIBOBIO/ miR1CM001

gga-let-7a-5p inhibitors RIBOBIO/ miR2CM001

micrON mimic NC RIBOBIO/miR1N0000001-1-5

micrOFF inhibitor NC RIBOBIO/miR2N0000001-1-5


第四章 GDF6 对 BMSCs 多向分化能力的影响


4.1 前言

MicroRNA 在体内发挥着重要的的调控作用。MiRNA 的调控功能的发挥是通过敲降其靶基因实现的,所以靶基因的功能研究也不容忽视。据上一章的实验结果可知GDF6 是 gga-let-7a-5p 的靶基因,gga-let-7a-5p 促进 BMSCs 向成骨细胞、肌肉细胞、神经细胞分化,抑制 BMSCs 向脂肪细胞分化,但 gga-let-7a-5p 的调控作用是否是通过靶基因 GDF6 发挥,未得到最终证明。根据已有的文献报道可知 GDF6 在生长发育过程中发挥着十分重要的作用,Mika 等的研究标明,当 GDF6 发生缺失或者突变时眼部骨骼发生缺陷[130];Meredith 等的研究发现 GDF6 对眼睛和中枢神经系统内的神经分化具有重要作用[131]。这些研究都证明 GDF6 在发育分化中扮演者不可或缺的角色,但是GDF6 对 BMSCs 的多向分化存在怎样的影响还未有研究报道。

本试验的目的是验证 gga-let-7a-5p 与 GDF6 是是否存在靶向作用关系,探究 GDF6对 BMSCs 多向分化功能的调控作用。通过对 BMSCs 进行 GDF6 过表达处理,再经过向成骨、脂肪、肌肉、神经细胞诱导分化,最后运用茜素红检测成骨诱导细胞钙盐沉积的情况,油红 O 染色检测成脂诱导细胞内脂肪滴形成情况,q-PCR 检测各种分化标志基因表达量的变化。最终证明 gga-let-7a-5p 是通过靶向 GDF6 对 BMSCs 多向分化发挥调控作用。为运用 BMSCs 治疗骨骼、神经、肌肉等疾病新靶点的选择提供实验基础。

参考文献(略)

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