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基于基因工程酯酶的农药残留快速检测方法思考[工程论文]

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  • 论文编号:el2021112820154323952
  • 日期:2021-11-28
  • 来源:上海论文网

基因工程论文哪里有?配方通过大肠杆菌表达系统获得重组的微生物酯酶,然后通过蛋白纯化仪,除去了粗酶液中的杂蛋白,并采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)对纯化结果进行验证,结果证明获得了高纯度的酶液。接下来对该酶的米氏常数,最适 pH ,最适温度,有机溶剂耐受性和干扰离子影响等进行了研究,为有机磷农药速测方法开发提供理论基础。

第一章  绪论

1.2 国内外基因工程酶的研究现状
1.2.1 当前酶抑制农残检测主要酶源
1.2.1.1 乙酰胆碱酯酶
AChE 被称为真性胆碱酯酶,是一类催化ACh 水解的酶,在生物神经传导中有重要作用,可以迅速将神经递质ACh 水解为胆碱和乙酸。AChE  催化反应的公式是:ACh +  H2O  →  胆碱  +  乙酸(Fukuto, 1990)。在农业生产中 OPs 通过抑制害虫的 AChE 活性从而杀死害虫,AChE 的抑制作用是由于酶活性位点中丝氨酸残基的磷酸化而引起的,磷酸化的酶丧失了水解 ACh 的能力,导致神经系统内 ACh 的聚积,该过程是一个不可逆的过程。来自不同来源的 AChE 对农药抑制反应的敏感性可能会有所不同(陈嘉  et al., 2001)。Marques 等比较了各种野生型 AChE 以及一些基因修饰的酶。在野生型酶中,来自电鳗的 AChE 比来自牛和人红细胞的 AChE 更敏感。然而,用黑腹果蝇的基因修饰的 AChE 获得了更高的敏感性(de Oliveira Marques et al., 2004)。根据 Marty等人的研究 AChE 的活性也受到 pH  的很大影响,必须建立最佳的操作条件(Marty et al., 1993)。丁酰胆碱酯酶(Butyrylcholinesterase, BuChE)也叫作假性胆碱酯酶,在酶抑制法农药检测中常用到 AChE 和 BuChE,但这两种酶使用不同的底物。根据 Andreescu 的研究,AChE 和 BuChE 的不同之处还在于,AChE 被过量的底物抑制,而 BuChE 不受过量的底物抑制,并且 AChE 和 BuChE对不同的农药有不同的最低检出限(Limit of detection, LOD)(Andreescu and Marty, 2006)。
1.2.1.2 碱性磷酸酶
碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)能从蛋白或核酸等物质上除去磷酸基团,基本反应如下:磷酸单酯  + H2O  →  醇  +  磷酸(Chen  et  al.,  2000)。ALP 的活性中心是由三联体 Asp101-Ser102-Ala103、两个锌离子和一个镁离子及配体氨基酸和 Arg166 组成,该酶在碱性环境下具有最大活性,拥有广泛的底物特异性(Coleman, 1992)。有研究表明,乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)对 ALP 的活性有明显的抑制作用(段晓霞  et al., 2020)。此外,OPs 也能够抑制 ALP 的活性,原理是 OPs 能与 ALP 活性中心的锌离子和镁离子结合(Olorunniji et al., 2007)。目前 ALP 尚未像 AChE 那样广泛地用于检测环境中的农药,有研究表明 ALP 能实现 OPs 和氨基甲酸酯类农药(Carbamate pesticides, CMs)的检测(Ayyagari et al., 1995 , Garcıá Sánchez et al., 2003)。但是尚未确定 ALP 是否可以作为合适的酶靶标用于环境中农药的酶法检测,检测真实样品中农药的能力也有待进一步证明。

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第三章  基于微生物酯酶和荧光分析的有机磷农药残留检测

3.1 实验仪器和材料

表 3-1  本章节主要实验仪器和试剂
表 3-1  本章节主要实验仪器和试剂

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第四章 基于微生物酯酶的有机磷农药速测试剂盒开发

4.1 实验仪器和材料

表 4-1  本章节主要实验仪器和试剂
表 4-1  本章节主要实验仪器和试剂 

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4.2 实验方法
4.2.1 不同浓度冻干液对冻干酯酶的影响
称取 1.14 g  牛血清白蛋白、3.43 g  蔗糖、1.14 g 吐温 20、0.46 g  聚乙二醇 20000、1.14 g PVP-40000 和 6.86g D-甘露醇,加入 0.10 mL Proclin 300  和 100 mL PBS(pH 7.5,50mM)配制成冻干液。在微生物酯酶溶液中分别加入 0.5%、1.0%、2.0%,5.0%、7.5%、10.0%、15.0%、20.0%、30.0%和 50.0%的冻干液,冷冻干燥后测定酶活,以酶活性最大的为 100%,计算各组的相对酶活。
4.2.2 微生物酯酶冻干方法优化
分别将微生物酯酶在-80℃冷冻 2 h,-20℃冷冻 12 h 和液氮速冻 3 min,最后将酯酶放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥 12 h。测定 3 种冻干方法下酶粉的酶活,以酶活最大的实验组为 100%,计算其他各组相对酶活。使用 3 种冻干方式制得的酶粉与敌敌畏进行抑制作用,计算各组抑制率。
4.2.3  反应条件优化
4.2.2.1 酶浓度优化
酯酶的浓度可能对基于酶抑制的农药残留检测方法有很大的影响。因此,在酶浓度范围为0.004-0.067 U/mL 的条件下进行优化,酶浓度分别为  0.004、0.008、0.017、0.034 和 0.067U/mL。不同浓度的酯酶分别与 0.1 mg/L 敌敌畏反应,测定抑制率。
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第五章 结论

5.1  主要结论
本研究选择了含有嗜热古菌 Archaeoglobus fulgidus 酯酶基因的重组大肠杆菌 BL21 进行表达纯化得到催化效率高、农药敏感性强的微生物酯酶,分析其酶学性质,优化反应条件建立了一种基于微生物酯酶与荧光分析的有机磷农药残留快速检测方法,并在此基础上对微生物酯酶进行冻干处理,提高酯酶的稳定性,能够满足实际检测需求。
主要结论如下
1.微生物酯酶表达纯化及酶学性质研究
通过大肠杆菌表达系统获得重组的微生物酯酶,然后通过蛋白纯化仪,除去了粗酶液中的杂蛋白,并采用 SDS-PAGE 电泳对纯化结果进行验证,结果证明获得了高纯度的酶液。接下来对该酶的米氏常数,最适 pH,最适温度,有机溶剂耐受性和干扰离子影响等进行了研究,发现该酶Km = 0.033 mmol/L,最适 pH 为 7.5,最适温度为 50℃。该对乙腈表现出较差的耐受性,但能耐受低浓度的甲醇和乙醇,甲醇和乙醇含量为 15%时剩余酶活约为 70%,葡萄糖、蔗糖、Na+,Ca2+、Al3+、Zn2+和 K+对微生物酯酶的活性没有明显的影响,在加入 0.1% BSA 作为稳定剂后,其活性在放置 240 min 后依旧较为稳定。
2.  基于微生物酯酶和荧光分析的有机磷农药残留检测方法
对 IDA、MUA、MUB 和 FDA 荧光量子产率较高的 4 种荧光底物进行筛选,选择 IDA 作为最适水解底物,建立了基于微生物酯酶和荧光分析的有机磷农药残留检测方法,并对方法的反应条件进行一系列优化,该方法最优条件为:酶浓度为 0.067 U/mL,底物浓度为 0.5 mmol/L,抑制反应时间为 15 min。在最优条件下测定 5 种有机磷农药的抑制率并建立标准曲线,以检测方法的灵敏性。结果显示,结果显示:敌敌畏、敌百虫、甲胺磷、丙溴磷和对氧磷最低检出限分别为 0.0032 mg/L、0.0096 mg/L、0.0990 mg/L、0.0990 mg/L 和  0.0074 mg/L,各农药的标曲方程的 R2均大于0.99,满足国家标准限量检测要求。  选择梨和大白菜为代表性样品,平均回收率在 80-105%之间,证明该方法能应用于实际样品中有机磷农药的检测。
参考文献(略)

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