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约氏疟原虫富含色氨酸抗原PyT RAg7对巨噬细胞炎症反应的调控作用及其机制思考
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  • 编辑:vicky
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  • 论文字数:35622
  • 论文编号:el2021111817082025294
  • 日期:2021-11-18
  • 来源:上海论文网

医学论文哪里有?本研究分析了 Balb/c 小鼠感染 P. y 17XL 后脾脏蛋白质组学的变化和揭示了约氏疟原虫蛋白 PyTRAg7 对 RAW264.7 巨噬细胞炎症反应的作用机制,为疟原虫–宿主相互作用和疟疾的致病机制提供了理论依据。


第一章  绪论


1.2 疟原虫致病机制的研究

1.2.1 脾脏在疟原虫感染中的作用

脾脏不仅是重要的免疫器官还是主要的造血器官,脾脏结构主要分为白髓(包含大部分免疫细胞)、红髓(包含正常红细胞和异常红细胞)和位于白髓和红髓之间的边缘区(包含大量巨噬细胞)[19]。脾脏复杂的结构和疟原虫寄生红细胞的特点决定了脾脏在疟疾中扮演着重要的作用。一方面脾脏可以检测异常的细胞从而清除受损的红细胞和 iRBC,另一方面脾脏的白髓区可以产生对疟原虫特异性的免疫反应(图 1-2)。人和啮齿动物脾切除后对感染疟原虫反应的研究,也都证实了脾对疟疾控制的重要性[20, 21]。

疟原虫感染可引起宿主剧烈的脾脏反应,脾脏大小已被用作确定流行地区疟疾传播强度指标[22]。在疟疾感染的红细胞阶段,脾脏是参与免疫应答和消除 iRBC的主要器官[19]。但是疟原虫可以通过逃避和调节免疫反应来建立慢性感染,有时还会引发不平衡免疫反应导致严重疾病[23]。脾脏中的免疫细胞和红细胞分别出现在脾的白髓区和红髓区,他们之间的接触机会是有限的。但机体感染疟原虫后,脾脏会发生一系列结构重塑的形态学改变,使白髓与红髓难以区分,这使免疫细胞接触 iRBC 变成可能[24, 25]。虽然小鼠与人的脾脏有解剖学上的差异,但许多形态特征是保守的。大量啮齿动物和人类研究表明复杂的疟原虫–宿主相互作用使脾脏在疟疾发病机制中发挥重要作用[26]。脾脏对宿主的保护和病理学双重作用更加凸显了对涉及机制进行研究的必要性,充分理解脾脏在疟疾致病中的作用。 

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第三章  PyTRAgs 蛋白的表达纯化


3.2 实验材料

3.2.1 实验试剂

表 3-1  实验试剂

表 3-1  实验试剂

在小鼠感染 P. y 17XL 4 天后,取小鼠的眼球血于 200 µL 抗凝剂中,4℃条件下 2000 rpm 离心 5 min 得到红细胞沉淀。采用 mRNA 提取试剂盒提取 P. y 17XL mRNA,先加入 500 µL 的裂解缓冲液,吹吸 10 s,涡旋振荡 10 s 以充分裂解细胞。加入等体积的乙醇溶液颠倒混匀,然后将所有液体加入吸附柱中,12 000g  离心 1 min。加入 500 µL 的清洗缓冲液洗涤柱子 2 次,开盖 2 min 使其晾干。最后加入 50 µL 的冲洗缓冲液,12 000g  离心 1 min,收集提取的 P. y 17XL mRNA。

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第五章  PyTRAg7 对 RAW264.7 巨噬细胞炎症调节机制的初步研究


5.1 前言

了解疟原虫–宿主相互作用的分子和细胞机制以及如何影响免疫应答引起发病机理,对于开发有效的治疗药物和疫苗至关重要。宿主先天免疫系统的各种受体可以识别肝内期和血内期的疟原虫,激活信号传导途径从而导致趋化因子和细胞因子的产生,这些免疫反应在清除疟原虫和形成保护性适应性免疫中起关键作用[27, 57, 76, 77]。然而,复杂的疟原虫–宿主相互作用并不有利于实现这一目标,而往往导致免疫反应失调和不受控制的寄生虫生长,最终导致发病机理。研究发现 PyTRAg7 可以刺激巨噬细胞诱导炎症反应,但是结合受体和作用机制尚不完全清楚。因此,本章旨在阐明 PyTRAg7 与巨噬细胞的结合受体和其诱导巨噬细胞炎症反应的作用机制。

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5.2 实验材料

5.2.1 细胞株

人肾上皮细胞 293T 购自中科院上海细胞库。

5.2.2 实验试剂

表 5-1  实验试剂

表 5-1  实验试剂

取 5×106 RAW264.7 巨噬细胞于 EP 管中,300 g 离心 5 min,用细胞清洗液清洗RAW264.7 巨噬细胞沉淀 2 次。弃上清液,加入 750 µL 透化缓冲液(PMSF+磷酸酶抑制剂),涡旋振荡充分透化,放置在冰上孵育 10 min。16 000 g 离心 15 min,弃含胞质蛋白上清液,加入 500 µL 增溶缓冲液(PMSF+磷酸酶抑制剂)重悬沉淀,于冰上孵育 30 min。16 000 g 离心 15 min,吸取上清液膜蛋白用 BCA 试剂盒测定蛋白,于–80℃保存。

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主要结果与展望


展望

本研究分析了 Balb/c 小鼠感染 P. y 17XL 后脾脏蛋白质组学的变化和揭示了约氏疟原虫蛋白 PyTRAg7 对 RAW264.7 巨噬细胞炎症反应的作用机制,为疟原虫–宿主相互作用和疟疾的致病机制提供了理论依据。后续还需要对以下几个方面进行进一步的研究:

(1)本研究主要研究了 PyTRAgs 家族中 PyTRAg7 对 RAW264.7 巨噬细胞免疫调节的影响,并未在 P. y 17XL 上进行实验。在今后的研究中可以运用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术敲除 pytrag7 基因,目前我们已经成功构建了基因敲除的供体质粒 PYC-sgRNA- PyTRAg7L-PyTRAg7R,进一步研究 PyTRAg7 蛋白是否在 P. yoelii 感染中扮演的重要角色。

(2)本研究以 RAW264.7 巨噬细胞为模型筛选了 PyTRAg7 结合受体 CD71,研究了 PyTRAg7 对巨噬细胞的炎症调节机制,并未在小鼠体内进行实验。在今后的研究中可以进一步在小鼠体内研究受体 CD71 对小鼠感染 P. y 17XL 炎症反应的影响。

参考文献(略)

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