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B7-H3通过调控PYCR1介导的脯氨酸代谢影响结直肠癌细胞的增殖和迁移
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  • 用途: 硕士毕业论文 Master Thesis
  • 编辑:vicky
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  • 论文字数:27888
  • 论文编号:el2021110310150325291
  • 日期:2021-11-03
  • 来源:上海论文网

医学论文哪里有?本课题聚焦 B7-H3 和 PYCR1 的预后价值及其对 CRC 发生发展的作用,收集 CRC患者组织样本,探索 B7-H3  和 PYCR1 的表达相关性和预后意义;同时构建了稳转株和瞬转株,研究 B7-H3 和 PYCR1 在 CRC 细胞中的调控关系以及对肿瘤表型的作用。


第一章  绪论


1.2 B7-H3 的结构、分布以及在肿瘤中的研究进展

1.2.1 B7-H3 的结构和分布

B7-H3 是由 Chapoval 等于 2001 年在人类树突状细胞的 cD NA 文库中发现的 B7 家族的新成员,因其在氨基酸序列上与 B7 家族其他成员的胞外域受体结合区有20%~27%的同源性且结构相似,所以被命名为 B7 Homolog 3(B7-H3)[27]。成熟的B7-H3 分子是一个编码大小为 316 个氨基酸的 I 型跨膜蛋白,包含 N 端的一个信号肽,一个具有细胞外的免疫球蛋白样可变区(IgV)和恒定区(IgC)、一个跨膜区和一个含有 45 个氨基酸的胞内区[28]。人体的 B7-H3 主要存在 2 种剪切体:胞外区由IgV-Ig C 组成的 B7-H3a (2Ig-B7-H3)和胞外区由 IgV-IgC-IgV-IgC 组成的 B7-H3b (4Ig -B7-H3)。小鼠的 B7-H3 分子只有 2Ig-B7-H3 结构域,而人类以 4Ig-B7-H3 亚型表达为主[29],此外人体中 B7-H3 除了表达在细胞膜上,还存在可溶性形式,可溶性 B7-H3分子主要存在于正常人外周血中,可能参与多种生物功能,但具体的调控机制及临床意义还有待探讨[28, 30]。

B7-H3 mRNA 广泛表达于几乎人类所有的免疫及非免疫组织器官,包括脾脏,胸腺、心脏、肝脏、前列腺、胎盘、睾丸、胰腺、小肠和大肠等,有趣的是,B7-H3 mRNA 在正常组织和细胞中表达水平较低,但在多种肿瘤组织和肿瘤细胞株中表达较高。相较于 B7-H3 mRNA 的广泛表达,B7-H3 在蛋白水平仅表达于少数正常组织如人体前列腺、乳房、肝、肺、膀胱、胎盘等,B7-H3 在转录水平和蛋白水平上的表达差异可能与转录后调控有关,然而具体的转录后调控机制目前仍不明确[31-33]。学者们推测,机体内可能存在某种机制抑制了 B7-H3 在机体正常组织中的表达,而 B7-H3 的异位表达可能是肿瘤免疫的机制之一。

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第三章  B7-H3 对 PYCR1 表达的调控和其在结直肠癌脯氨酸代谢中的作用探讨


3.1  实验材料

3.1.1  细胞株

细胞株

细胞株

(1)DMEM  完全培养基:配制血清浓度 10%的完全培养基:450ml DMEM  细胞培养基+50ml  胎牛血清+5ml  链霉素+5ml  青霉素;

(2)细胞冻存液:胎牛血清、DMEM  培养基和 10% DMSO 的比例为 5:4:1;

(3)1x PBS:取 10x PBS,用双蒸水稀释 10 倍后置于容量瓶中,高温灭菌用于细胞实验;

(4)10% APS:在电子天平上称重 0.1g 晶体,溶于 1ml 双蒸水中,并搅拌混匀; 

(5)10x running buffer:分别称取 Tris 30g,SDS 10g,glycine 144g,  加双蒸水定容至 1L,并搅拌混匀;

(6)1 x running buffer:量取 10x running buffer 100ml 于烧杯中,倒入 900ml 的双蒸水,并搅拌混匀 

(7)10 x trans buffer:  分别称取 Tris 30g 和 glycine 144g,溶于 1l 双蒸水中,搅拌混匀;  (8)10 x TBS:分别称取 Tris 24.2g 和 NaCl 80g,溶于 1l 双蒸水中,搅拌混匀; 

(9)1 x TBS:量取 10x TBS 100ml 于烧杯中,倒入 900ml 的双蒸水,并混匀; 

(10)1 x TBST:取 500ml 配置好的 1x TBS,吸取 1ml  吐温溶于 TBS 中,吹打混匀; 

(11)转膜液:纯水、无水乙醇和 10x trans buffer 溶液的配置比例为 7:2:1,搅拌混匀; 

(12)5%牛奶:称取 2.5g  奶粉倒入装有 50ml 1x TBST 的抗体盒中,将抗体盒置于摇床上,充分混匀; 

(13)10%SDS:称取 1g SDS  粉末,倒入  10ml  双蒸水中。

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第四章  B7-H3 与 PYCR1 表达对结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移的作用研究


4.1  实验材料

实验所使用的细胞株为:

实验所使用的细胞株

实验所使用的细胞株

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4.2  实验方法

4.2.1 CCK-8(Cell Counting Kit-8)测细胞增殖

(1)细胞计数:培养肠癌细胞,待细胞密度达到 70%-90%时,在超净工作台中,用胰酶试剂消化贴壁的细胞,吸取细胞悬浮液至 1.5ml 管中,速度 1000 rpm/min 离心 5 min,得到细胞沉淀。加入 1ml 的完全培养基,用移液枪将细胞吹匀打散得到细胞悬液。拿出细胞计数板,用 PBS 将细胞悬液稀释 10 倍,再滴加于细胞计数板上,显微镜下对细胞进行计数;

(2)准备无菌 96 孔板,每孔接种 1500 个细胞,每株细胞设置 5×6 个复孔,共测量 5 天。按照计数结果吸取细胞悬液置于 96 孔板中,不足 100ul 悬液的孔,用完全培养基补充至 100ul,加样结束后,将 96 孔板放置于细胞培养箱继续培养。注意全程无菌操作,并做好样品标记;

(3)次日,镜下观察细胞状态后,从 4℃冰箱中取出 CCK-8 试剂,用无血清培养基配制 10% CCK-8 溶液,并混合均匀。用微型台式真空泵吸弃 6 个孔中的细胞培养液,每孔加入 100µƖ 的 10% CCK-8 溶液,同时设置 3 个空白孔,空白孔中同样加入10 % CCK-8 溶液。加样结束后,将孔板放入培养箱孵育 1.5h;

(4)打开酶标仪,从培养箱中取出 96 孔板,在 450 nm 处进行测量,测量完成后导出实验数据,并将 96 孔板放回培养箱继续培养;

(5)其余四天的检测方法和测量时间与第一天一样,将每一天的实验数据进行保存。

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第五章  结论与展望


5.1  主要结论

本课题聚焦 B7-H3 和 PYCR1 的预后价值及其对 CRC 发生发展的作用,收集 CRC患者组织样本,探索 B7-H3  和 PYCR1 的表达相关性和预后意义;同时构建了稳转株和瞬转株,研究 B7-H3 和 PYCR1 在 CRC 细胞中的调控关系以及对肿瘤表型的作用,现将主要结论陈述如下:

(1) 在 CRC 患者组织中,B7-H3 和 PYCR1 表达显著升高且具有表达相关性,B7-H3 和 PYCR1 高表达预示了患者更差的生存。

(2) 在 CRC 细胞中,B7-H3 可以通过激活 PI3K 信号通路调控 PYCR1 的表达。

(3)  在 CRC 细胞中,B7-H3 可以通过调控 PYCR1 来影响肿瘤的脯氨酸代谢。

(4)  B7-H3 可以调控 PYCR1 促进 CRC 细胞的增殖、侵袭和迁移能力。

参考文献(略)