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胰岛素类似物的质谱表征研究
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  • 编辑:若诗
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  • 论文编号:el2021011221450021359
  • 日期:2021-02-18
  • 来源:上海论文网
本文医学论文,本文以门冬胰岛素和德谷胰岛素为研究对象,探讨了质谱在胰岛素类似物质量控制中的应用,分别从初级结构、高阶结构以及手性杂质测定等方面进行的深入的研究,为胰岛素类似物的质量控制提供了技术指导。结论如下:(1)此方法免去了传统序列分析中的昂贵且费时的测序级蛋白内切酶的使用,限制引入酶切修改序列的风险,节省了成本,并显著提高了工作效率,为胰岛素类似物的序列分析提供了一种新的解决方案。胰岛素类似物采用基因工程技术合成,首先生物合成胰岛素原,再用蛋白酶酶切去C肽得到胰岛素。由于酶切位点的限制和后续化学修饰的要求,需要化学引入氨基酸,这会引入D型氨基酸的污染,导致消旋肽的产生。我们建立了液相色谱-高分辨质谱(LC-HRMS)检测手性氨基酸杂质的方法,并优化了消旋肽水解成氨基酸以及手性氨基酸与衍生化试剂的反应条件,显著提高了L/D-苏氨酸和谷氨酸的检出限以及线性范围。

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第一章绪论

 

本论文的主要研究内容为:(1)首次采用“自上而下”的高分辨质谱法对门冬胰岛素和德谷胰岛素进行了完整的序列分析,序列覆盖率达到100%。本研究尝试将胰岛素还原后不经酶解即注入液相色谱-高分辨串联质谱进行检测,以实现“自上而下”的快速序列分析。通过优化胰岛素还原成两条单链的反应条件,以及串联质谱的碰撞条件,实现了门冬胰岛素和德谷胰岛素的序列表征,包括其A链和B链蛋白序列分析、德谷胰岛素B链C末端侧链非蛋白修饰序列分析。(2)二硫键的存在会显著抑制肽链的质谱碎裂,尤其是链内二硫键所形成的肽链环内的碎裂,常规的CID和HCD对此无能为力,为此我们采用SID的碎裂方式可以有效提高环内肽链的碎裂,以获得验证二硫键连接的关键质谱碎片。首次采用酶切质谱法和SID质谱法联合解析了门冬胰岛素二硫键,验证了门冬胰岛素的三种二硫键存在方式。(3)蛋白质药物HOS的轻微变化都可能影响其功效和安全性。HDX是一种著名的研究蛋白质HOS的技术。避免氢氘原子回交换、提高HDX实验准确性和重现性以及快速检测是HDX-MS技术广泛应用的瓶颈。

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第二章基于高分辨质谱的胰岛素类似物的序列分析

 

2.1引言
二硫键对于稳定蛋白质的结构,保持和调节其生物学功能具有极其重要的意义[174-177]。首先,它们影响蛋白质折叠的热力学:二硫键稳定蛋白质的天然构象为不稳定的展开形式,它们降低了展开形式的熵,通过限制能量上有利的构象变化来降低折叠蛋白的稳定性。其次,它们保持蛋白质的完整性:细胞外环境中的氧化剂和蛋白水解酶可以使蛋白质失活。通过稳定蛋白质结构,二硫键可以保护蛋白质免受损害并延长其半衰期。二硫键的形成促使肽链的不同位置的疏水氨基酸残基围绕二硫键形成疏水中心区域,拒绝水分子进入肽链内部,形成稳定的高级结构区域[178]。胰岛素由两条肽链(A链和B链)组成,包含6个半胱氨酸残基,分别形成1条链内二硫键(A:C6=A:C11)和2条链间二硫键(A:C7=B:C7和A:C20=B:C19)。大量与胰岛素相关的小蛋白,包括胰岛素、胰岛素类似物、胰岛素样生长因子、松弛素亚家族和胰岛素样肽,它们都有上述保守的6个半胱氨酸残基以及相同的二硫键连接方式[19]。

 

2.2实验材料
超高效液相色谱系统(AcquityUPLC,美国WATERS公司),静电场轨道阱高分辨质谱仪(OrbitrapVelosPro,美国ThermoFisherScientific公司),涡旋振荡器(MS3,德国IKA公司),高速冷冻离心机(3K15,德国SIGMA公司),电子天平(BS224S,德国赛多利斯公司),电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9145A,上海精宏实验设备有限公司),超滤离心管(3K,美国Pall公司)。二硫键的存在会显著抑制肽链的质谱碎裂,尤其是链内二硫键所形成的肽链环内的碎裂,常规的CID和HCD对此无能为力,为此我们采用SID的碎裂方式可以有效提高环内肽链的碎裂,以获得验证二硫键连接的关键质谱碎片。本章首次采用酶切质谱法和SID质谱法联合解析了门冬胰岛素二硫键,验证了门冬胰岛素的三种二硫键存在方式:链内二硫键(A:C6=A:C11)、链间二硫键(A:C7=B:C7)和链间二硫键(A:C20=B:C19)。本方法具有分析速度快、操作过程简单等优点。本实验所建立的门冬胰岛素二硫键分析方法可推广应用于其它胰岛素类似物的二硫键分析。大多数蛋白质都包含二硫键,这是成对的半胱氨酸残基之间以共价连接方式所形成的纽带。二硫键的形成是常见的翻译后修饰,其共价连接两条单独的肽链(链间二硫键)或使一条链的某一部分形成环(链内二硫键)[173],以增强蛋白质或蛋白质复合物的正确构象。

 

第三章基于高分辨质谱的胰岛素类似物的二硫键分析..................49
3.1引言..................................................................................................49
3.2实验材料..........................................................................................51
3.3实验方法..........................................................................................52
第四章基于MALDI-TOFHDX-MS的胰岛素类似物的高阶结构分析........................................................60
4.1引言..................................................................................................60
4.2实验材料..........................................................................................63
4.3实验方法..........................................................................................64
4.4结果与讨论......................................................................................67
第五章基于高分辨质谱的胰岛素类似物的手性氨基酸杂质分析.......................79
5.1引言..................................................................................................79
5.2实验材料..........................................................................................82

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第五章基于高分辨质谱的胰岛素类似物的手性氨基酸杂质分析

 

5.1引言
为此我们开发了固相微萃取样品靶的MALDI-TOFMS与HDX相结合研究胰岛素类似物HOS的方法,有效地解决了上述问题,并以高通量的方式比较胰岛素类似物HOS的构象差异,以实现胰岛素类似物的快速、批量分析,并研究了药物辅料及存储条件对胰岛素类似物的动力学和构象影响。文拟采用LC-MS间接衍生化法,对门冬胰岛素的手性氨基酸杂质苏氨酸和德谷胰岛素的手性氨基酸杂质谷氨酸水解后进行柱前衍生化反应,再以反相非手性HPLC分离测定手性氨基酸杂质相对含量。本文优化了氨基酸衍生反应的条件以及LC-MS检测衍生产物的液相方法和质谱方法,显著提高了LC-MS法检测手性氨基酸杂质的检出限以及线性范围。
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5.2实验材料
消旋肽须水解成游离氨基酸才能进行衍生化分析,我们采用氘代盐酸/氘代乙酸水解德谷胰岛素的Glu-C酶酶解产物肽段Ⅳ,以此避免了盐酸水解导致的外消旋化干扰。氨基酸的FDAA衍生化反应受反应温度和反应方式的影响很大,本研究表面振摇能显著加快反应速度,在37℃下反应4h,苏氨酸和谷氨酸的FDAA衍生化反应趋于平稳。LC-MS/MS法检测氨基酸FDAA衍生产物,由于无法保证L/D-氨基酸获得相同的含量-质谱信号强度线性关系,因此该方法不能直接根据L/D-氨基酸的相对峰面积比值来表征相对含量比值。LC-HRMS法检测手性氨基酸杂质,显著提高了检测L/D-苏氨酸和谷氨酸的检出限以及线性范围,其中苏氨酸的定量检出限为2.2nmol/L,谷氨酸的定量检出限为2.5nmol/L,线性范围为2.5-25000nmol/L。
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结论
(2)本研究首次采用酶切质谱法和SID质谱法联合解析门冬胰岛素二硫键,验证了门冬胰岛素的三种二硫键存在方式。本方法具有分析速度快、操作过程简单等优点,所建立的二硫键分析方法可推广应用于其它胰岛素类似物的二硫键分析。(3)基于MALDI-TOFMS固相微萃取样品靶的原位脱盐、浓缩技术,本研究有效地避免了氢氘原子回交换、提高HDX实验准确性和重现性。本方法能够以高通量的方式比较胰岛素类似物HOS的构象差异,以实现快速、批量分析,并能研究药物辅料及存储条件对蛋白类药物的动力学和构象影响。结果表明,苯酚对门冬胰岛素和德谷胰岛素注射液中六聚体的维持起到了积极的作用;过高的存放温度会影响注射液中胰岛素的HOS,导致其药效可能发生变化,尤其对于速效胰岛素:门冬胰岛素的影响更大些。
参考文献(略)