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野生云南山楂果实的化学成分与降脂活性探讨
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  • 用途: 硕士毕业论文 Master Thesis
  • 编辑:vicky
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  • 论文字数:38666
  • 论文编号:el2021112419312325779
  • 日期:2021-11-24
  • 来源:上海论文网

药学论文哪里有?本研究对野生云南山楂果实进行了化学成分的分离鉴定,以及体外降脂活性的测定,测定结果显示 2α,19α-二羟基-3-氧-乌苏-12-烯-28-酸(7)、蔷薇酸(8)、槲皮素(11)、根皮素(14)和根皮苷(15)具有一定的体外降脂活性,为该植物果实中的降脂活性成分之一。此外,本研究在第二章综述了根皮苷的药理作用,其中降糖降脂活性研究一直以来都是学者研究根皮苷生物活性中的重点领域之一。综上所述,野生云南山楂果实中鉴定的三萜类和黄酮类化合物,均被报道具有一定的降脂活性。因此,本研究为进一步研究该植物的降脂活性化学成分提供了一定的依据,为进一步的开发降脂活性较好的天然产物提供了一定的物质基础。 


1  野生云南山楂果实的化学成分研究


1.1  实验部分

1.1.1  仪器与材料

Bruker Avance  Ⅲ-400 核磁共振波谱仪(德国布鲁克公司),四甲基硅烷(TMS)为内标;SGW-3 自动旋光仪(上海仪电物理光学仪器有限公司);Buchi R-210 旋转蒸发仪(瑞士步琦公司);柱层析硅胶和薄层层析硅胶板 GF254(青岛海洋化工厂);Sephadex LH-20(瑞典安发玛西亚生物技术公司);D101 大孔吸附树脂(天津波鸿树脂科技有限公司);石油醚、乙酸乙酯、氯仿、丙酮、甲醇均为工业纯,经重蒸后使用。

本实验所用植物样品于 2018 年 10 月采自云南大理苍山,经大理大学药学院生药学教研室张德全教授鉴定为云南山楂[Crataegus scabrifolia (Franch.) Rehd.]野生种的果实,植物标本(编号 20181009-2)保存于大理大学药物研究所。

1.1.2  提取及分离

植物提取:野生云南山楂果实 6.4 kg,粉碎后,95%乙醇冷浸提取 4 次,冷浸液经减压浓缩后得到总浸膏 2.7 kg,计算提取率为 42.3%。

化合物分离:野生云南山楂果实总浸膏(2.7 kg),以 2.7 kg 80~100 目硅胶吸附后经 200~300 目硅胶柱层析,氯仿-丙酮溶剂系统(氯仿-丙酮 1:0→0:1)梯度洗脱,最后用甲醇洗脱,在 TLC 的检测下合并相同流分得 8 个组分(Fr.1~Fr.8)。

Fr.1(13.5 g)经硅胶柱层析(石油醚-乙酸乙酯 15:1)、Sephadex LH-20 凝胶柱层析(氯仿-甲醇 1:1)得化合物 1 与 2(3.730 g)。

图 1.1   野生云南山楂果实的化学成分分离流程图

图 1.1   野生云南山楂果实的化学成分分离流程图 

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2  野生云南山楂果实中主成分的含量测定


2.1  仪器与材料

高效液相色谱仪 1260(美国安捷伦科技有限公司),甲醇(西格玛奥德里奇上海贸易有限公司),纯净水(娃哈哈饮用纯净水),2 mL 液相色谱进样瓶(安捷伦科技中国有限公司),万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)。

化合物 15、化合物 17(样品中分离得到,纯度>90)。本实验所用植物样品于 2018 年 10 月采自云南大理苍山,经大理大学药学院生药学教研室张德全教授鉴定为云南山楂[Crataegus scabrifolia (Franch.) Rehd.]野生种的果实,植物标本(编号 20181009-2)保存于大理大学药物研究所。

表 1.2   液相梯度洗脱表

表 1.2   液相梯度洗脱表

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3  野生云南山楂果实的降脂活性研究


3.1  仪器与材料

仪器:BSC-1000Ⅱ  A2 生物安全柜(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司);5510E CO2 培养箱(美国 Nuaire 公司);DT5-6 低速台式离心机(北京时代北利离心机有限公司);M700E 倒置显微镜(日本 Nikon 公司);Varioskan LUX 多功能酶标仪(美国 Thermo Fisher Scientific 公司);Coolsafe 95-15 冷冻干燥机(丹麦 LaboGene 公司);AL204 电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);HVE-50 高压灭菌锅(日本 Hirayama 公司);DW-86L 628 -80℃低温冰箱(青岛海尔特种电器有限公司);RE-5205 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

试药:人肝癌细胞株(HepG2)由中国科学院昆明植物研究所黎胜红研究员惠赠;Gibco 澳洲特级胎牛血清、Gibco RPMI 1640 干粉培养基(美国 Invitrogen公司);4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、青霉素-链霉素溶液、胰蛋白酶-EDTA消化液(北京索莱宝科技有限公司);油酸(OA)、油红 O(上海麦克林生化科技有限公司);牛血清白蛋白(BSA)(德国 Biofroxx 公司);棕榈酸钠(PA)(上海源叶生物科技有限公司);二甲基亚砜(DMSO)(美国 Sigma 公司);辛伐他汀(美国 Ark Pharm 公司)。

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3.2  实验方法

体外降脂活性测试:参考文献中的方法[38-40],并进行适当改良,具体如下:将 HepG2 细胞(1.5×104个/孔)接种于 96 孔板上,置 37 °C 和 5% CO2 环境下培养至细胞丰度达 90%以上时,以 40%牛血清白蛋白(BSA)结合的 0.6 mM 的油酸和 0.3 mM 的棕榈酸钠诱导。24 h 后,供试组每孔加入 20 μL 供试物溶液,终浓度为 0.5 mg/mL,空白组和模型组每孔加入 20 μL 相应溶媒。继续培养 24 h 后,小心移除孔内培养液,每孔加入 60 µL 10%甲醛溶液固定 30 min。随后移除固定液,每孔加入 60 µL 0.4 mg/mL 油红 O 工作液染色,60 min 后用 PBS 冲洗 3 遍,置倒置显微镜下观察细胞内脂滴染色情况。最后每孔加入 200 μL 异丙醇,并用酶标仪测定 510 nm 下各组的 OD 值。降脂率按以下公式计算:降脂率% = [1−(供试组 OD 值−空白组 OD 值)/(模型组 OD 值−空白组 OD 值)]×100。 

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4 结果讨论

本课题系统地研究了野生云南山楂(野生种)果实的化学成分,运用硅胶、聚酰胺、Sephadex LH-20 等柱色谱法、并通过理化性质及现代波谱分析等手段从野生云南山楂果实 95%乙醇提取物中分离鉴定了 26 个化合物,涉及到三萜、黄酮及其苷类、甾体及其苷类、酚酸类、短链脂肪酸脂及长链脂肪酸类化合物,其中三萜类和黄酮及其苷类为其主要成分。截止目前为止,仅斯建勇等对云南山楂的果实和叶进行了化学成分研究,报道了 10 个常见的黄酮、三萜类化学成分[5,6],并未发现有橙酮苷、短链脂肪酸脂类成分,本研究从该植物中分离得到了 2 个橙酮苷类、1 个酚酸类及 3 个脂肪酸类,丰富了该植物的化合物成分类型,为进一步研究该植物的化学成分提供了一定的依据。

野生云南山楂果实中已分离鉴定的化学成分涉及到了橙酮类型,即化合物19 和化合物 20。其中化合物 19 在13C-NMR 中分别出现两组相同信号,后经HPLC 分析结果显示化合物 19 为一组单峰,猜测化合物 19 为一单体化合物。化合物 19 中存在 2 位半缩酮结构,在溶剂存在条件下半缩酮不稳定,容易发生键的断裂,2 位生成-C=O,此时 8-OH 会有两个方向可以进攻生 2-C=O 生成 2-OH,此时化合物 19 中 C-2 存在 R/S 两个构型,即化合物 19 在溶剂中为一动态平衡状态,合理的解释了化合物 19 在3C-NMR 中出现两组相同信号的原因,同时与文献报道数据基本一致,故鉴定该化合物为一单体化合物(alphitonin 4-O-β-D-glucoside)。另外,在化合物 20 中 9、10 位为双键,结构中不存在半缩酮结构,因此在谱图中仅显示出一组信号。 

本研究对野生云南山楂果实进行了化学成分的分离鉴定,以及体外降脂活性的测定,测定结果显示 2α,19α-二羟基-3-氧-乌苏-12-烯-28-酸(7)、蔷薇酸(8)、槲皮素(11)、根皮素(14)和根皮苷(15)具有一定的体外降脂活性,为该植物果实中的降脂活性成分之一。此外,本研究在第二章综述了根皮苷的药理作用,其中降糖降脂活性研究一直以来都是学者研究根皮苷生物活性中的重点领域之一。综上所述,野生云南山楂果实中鉴定的三萜类和黄酮类化合物,均被报道具有一定的降脂活性。因此,本研究为进一步研究该植物的降脂活性化学成分提供了一定的依据,为进一步的开发降脂活性较好的天然产物提供了一定的物质基础。 

参考文献(略)

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