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多能化干细胞培养环境及多能化相关分析

日期:2013-11-22 14:03 作者:上海论文网 编辑:lgg 点击次数:212
销售价格:0 论文编号:el201311221403345844 论文字数:4546 所属栏目:毕业论文
论文地区: 论文语种:其他 论文用途:其他
TAG: 安全性   效率   胚胎干细胞   多能性   临床   

无论是对人的胚胎干细胞进行多能性状态的改变还是直接在诱导多能性干细胞的过程中得到 na ve 状态的人的多能性干细胞,最终都是为了将人的多能性干细胞更好的应用于将来的再生医疗服务

1 前言


多能性干细胞具有自我更新和分化为体内各类型细胞的能力,因此多能性干细胞在未来的细胞治疗中会起着举足轻重的作用。追述多能性干细胞研究的历史是从胚癌细胞细胞开始的,它也展现一定的增殖能力和分化能力,但毕竟核型不正常,尤其当胚胎干细胞被建立之后,大家还是更加关注多能性干细胞的研究[3],可以概括为以下几个方面:多能性干细胞自我维持机制的研究,获得方式的研究,不同物种的比对和临床级别多能性干细胞的建立。这些方面都是相互影响,相辅相成,科研的最终目的是为人类谋福祉,而对多能性干细胞的研究也是如此,只有对多能性有深入了解才能建立完善的培养体系,才能创造出更安全的多能性细胞产生方式,才能完成物种间的对比,为人多能性干细胞的临床应用作铺垫。以下就将针对这几个方面的研究做综述。


1.1 细胞的定型( 建议改为“细胞的命运决定与分化”)
受精是一个个体发育的开始,在大家普遍认为八细胞之前胚胎的每个卵裂球都是全能性的,每个卵裂球都可以完整支持胚胎的发育。通常认为在桑椹胚晚期的时候细胞已经开始定型。3.5 天之后的内细胞团也会呈现两种细胞类型:原始外胚层(primitive ectoderm)和原始内胚层(primitive endoderm)细胞。原始内胚层细胞最终参与胚外组织(extraderm)的发育,原始外胚层可以进一步发育为上胚层(epiblast),支持个体的发育。伴随这样一个细胞定型的过程,很有可能有些细胞在转化的过程中一直保持着多能性的状态,甚至是全能性的状态。限于目前技术手段等限制,很难将这种细胞分离出来并证明其多能性的状态。而目前所能做的是对一类细胞进行功能验证,检测或者是对一类细胞群体进行分离。通过前后两个阶段的对比,很容易确定两个细胞群体有否区别,并能够给出一些证据。但是这些数据的出现只是一些高通量,或者认为有理论根据的数据,并且这些数据也是一种相对定量的统计结果,无法给出绝对的定义。这个是最令所有人迷惑的地方,怎样将所占很小比例的细胞的比重进行合理放大,这才是目前应该研究的一个命题。想要对这个问题进行完整的解答还是要回到植入前胚胎的发育,再到植入后胚胎的发育过程中来。多能性是在胚胎发育到一定阶段,一般是上胚层时期,通过体外分离培养使之维持增殖并具有分化能力的状态。建立多能性干细胞的方式很多,但总的来说有两种:胚胎来源和体细胞来源。胚胎来源的多能性干细胞被称为胚胎干细胞。由于胚胎干细胞和胚胎生殖细胞类似,这说明胚胎干细胞和胚胎生殖细胞有共同的起源。或者胚胎干细胞来源其前体或本身的转化。目前很难对这个问题进行解答。首先不知道对每个的细胞的界定标准是什么,因为根据目前的研究结果来看,无论是胚胎干细胞还是上胚层干细胞,它们的均质性非常差,至少是分群的。这就很难去寻找两种不同的细胞类型起源(如图 1-1 示)。


1.2 小鼠胚胎干细胞的研究进展
第一株小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mouse ESCs)是在 1981 年从体外培养的囊胚建立的[7, 8],具有三胚层的分化能力。胚胎干细胞的出现代替了畸胎瘤胚胎细胞的研究,使人们对畸胎瘤胚胎细胞的研究不再那么关注,胚胎干细胞的出现改变了现有的对多能性干细胞的理解,多能性干细胞在没有核型异常的情况下依然存在[3, 9]。之后小鼠胚胎干细胞的多能性被进一步验证,不仅具有自我更新和分化能力,也可以通过嵌合体实验进行生殖系的传递,黄金标准是通过四倍体补偿实验可以得到存活的动物[10]。在小鼠胚胎干细胞出现之后,人们进一步发现了多能性干细胞的自我更新机制,白血病抑制因子(LeukemiaInhibitory Factor,LIF)在维持多能性细胞的生长和自我更新,这种因子的发现是在通过饲养层培养小鼠胚胎干细胞时发现的[11, 12]。它属于白细胞介素 6(IL-6)的家族成员。LIF 因子可以结合细胞膜表面的受体 LIF 受体(LIFRβ)和 gp130。二聚体 LIFRβ-gp130 又可进一步作用下游通路的 STAT3,可以磷酸化 c-MYC 蛋白 58 位的苏氨酸,从而进一步调控多能性基因的表达[10, 13]。


2 材料与方法


2.1 实验材料
2.1.1 实验动物和材料
C57BL/6,是一近交系背景的小鼠重症联合免疫缺陷小鼠 (Severe Combined Immunodeficiency Mice; SCID mice)上述动物购自北京维通利华实验动物技术有限公司东北民猪,哈尔滨三元公司杜洛克猪,北京昌平大动物实验基地胎儿包皮,北京儿童研究所


2.2 实验方法


2.2.1 细胞培养
2.2.1.1 小鼠胎儿成纤维细胞的分离和培养
取 13.5 天的孕鼠,断颈法处死后,取出子宫,置于盛有 PBS 的皿中,将子宫一侧提起剪断,另一侧也提出时剪开,从鼠体分离开来。剥掉子宫膜和羊膜取出胚胎,置于 PBS 的另一个皿中。去头、四肢、尾和肝脏。用 PBS 洗两次之后充分剪碎,再加 PBS 洗一次,并将组织碎块和 PBS 一起转移至一个小的培养皿中,倾斜静止,待组织块下沉后,吸出 PBS。加入 3ml PBS,2ml 0.05%的胰酶/EDTA,吹打消化 2-3 分钟。加入 5ml 成纤维细胞培养液终止胰酶消化。900rpm, 10min,弃上清,加入 2-3ml 成纤维细胞培养液,重悬细胞沉淀。补充培养液, 于 10cm 的细胞培养皿中培养,第二天换液培养。获得的原代胚胎成纤维细胞记为P0代。再传代为 P1,2….,在成纤维细胞培养液中培养,可在 4-5 代内作为饲养层细胞使用,使用丝裂霉素处理或经射线照射后方可作为饲养层细胞(feeder cell)。


3 结果与分析 ....26
3.1 通过培养体系的优化将人 ES 细胞转化.....26
3.2 快速诱导具有小鼠 ES 细胞样猪 iPS 细胞 .......32
3.3 临床级别人孤雌 ES 细胞建系....40
3.3.1 临床级别饲养层的准备.......40
3.3.2 临床级别干细胞系的建立.........41
3.3.3 多能性及生物安全性检测.........43
4 讨论 ..........47
4.1 环境决定细胞的命运 .....47
4.1.1 人的多能性状态的转换.......47
4.1.2 猪 iPS 细胞的诱导及应用 .........48
4.2 多能性干细胞的未来 .....48
5 结论 ..........50


结论


本研究主要通过改变培养体系和外源因子导入的方法尝试获得小鼠 ES 细胞样的其他物种的多能性干细胞,并对所得干细胞的多能性进行了深入分析和应用检验,主要结论如下:
(1) 通过基础培养液的改变(LBX 培养液)和小分子(SU5402,PD025901,CHIR99021,Forskolin,VC 和 SB431542)的添加,可以将人 ES 细胞(H9和 P-TJ)转变成小鼠 ES 样细胞。
(2) 通过培养体系的改善可以提高猪 iPS 细胞的诱导效率,并得到两种不同状态的猪 iPS 细胞:pips_h 和 pips_m 细胞,两种细胞在多种细胞生物学特征上具有显著的区别。
(3) 从人的孤雌胚胎可以成功建立临床级别的胚胎干细胞系,并通过多能性的和生物安全性的各种检测。


参 考 文 献
[1] M.A. Esteban, J. Xu, J. Yang, M. Peng, D. Qin, W. Li, Z. Jiang, J. Chen, K. Deng,M. Zhong, J. Cai, L. Lai, D. Pei, Generation of induced pluripotent stem cell lines fromtibetan miniature pig, J Biol Chem, (2009).
[2] T. Ezashi, B.P. Telugu, A.P. Alexenko, S. Sachdev, S. Sinha, R.M. Roberts, Derivationof induced pluripotent stem cells from pig somatic cells, Proc Natl Acad Sci U S A, 106(2009) 10993-10998.
[3] D. Solter, From teratocarcinomas to embryonic stem cells and beyond: a history ofembryonic stem cell research, Nat Rev Genet, 7 (2006) 319-327.
[4] T.P. Zwaka, J.A. Thomson, A germ cell origin of embryonic stem cells?, Development,132 (2005) 227-233.
[5] K. Hayashi, S.M. Lopes, F. Tang, M.A. Surani, Dynamic equilibrium and heterogeneityof mouse pluripotent stem cells with distinct functional and epigenetic states, CellStem Cell, 3 (2008) 391-401.
[6] J. Nichols, A. Smith, The origin and identity of embryonic stem cells, Development,138 (2011) 3-8.
[7] M.J. Evans, M.H. Kaufman, Establishment in culture of pluripotential cells from mouseembryos, Nature, 292 (1981) 154-156.
[8] G.R. Martin, Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos culturedin medium conditioned by teratocarcinoma stem cells, Proc Natl Acad Sci U S A, 78 (1981)7634-7638.
[9] G.R. Martin, Teratocarcinomas and mammalian embryogenesis, Science, 209 (1980)768-776.
[10] R. Jaenisch, R. Young, Stem cells, the molecular circuitry of pluripotency andnuclear reprogramming, Cell, 132 (2008) 567-582.

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