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CRISPR/Cas9 高效等位基因编辑系统的构建及其在猪基因组编辑中的应用研究

时间:2018-01-18 18:20来源:www.e-lunwen.com 作者:lgg 点击:
本文是基因工程论文,本研究在哺乳动物细胞水平建立了一套高效的 CRISPR/Cas9 人工核酸酶介导的Rep/Don 打靶系统,Rep/Don 打靶系统既可以作为报告系统反应核酸酶的活性和外源基因的整合
第一章 文献综述
 
1.1 基因组编辑
自从发现基因是遗传信息的携带者和DNA的结构后,研究者对基因研究充满了兴趣,随着新的测序技术的发展,许多物种的全基因组测序已完成,大量的测序数据,有助于基因功能的研究和应用。许多科研工作者在基因组的特定位点上进行操作来研究基因的功能,这种方法成为后基因组阶段研究基因功能的主要手段。在基因组上的操作即是基因组编辑(Genome editing),是指利用机体内DNA自身的修复机制实现DNA的删除、插入或替换,对基因组进行修饰的技术手段。传统的基因组编辑主要是利用细胞内自发同源重组整合外源基因对基因组进行修饰。但是这样的方式效率非常低(约10-7),还有很多随机整合发生(Capecchi, 2005)。基于这个原因,传统的基因组编辑仅适用于能检测大量的转染细胞筛选出极稀少的打靶的酵母细胞和可培养的哺乳动物细胞(Hinnen et al.,1978; Thomas et al., 1986),而在其他物种的细胞中很难运用(Hsu et al., 2014)。DNA损伤会产生DNA双链断裂(DNA double strand breaks, DSBs),这种断裂通常对细胞是有毒的,会导致基因组的不稳定及引起疾病的基因突变。但是,当靶位点出现双链断裂时,基因打靶的效率会大大增加,提高50000倍(Bibikova et al., 2001)。当DNA双链断裂后,会激发体内的DNA修复机制,DNA的修复机制不但能修复损伤,还存在一些如减数分裂重组、抗体类别转换、VDJ重排等重要的生物进程中。DNA双链断裂会引发两种主要的修复机制:非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)和同源重组(homology-directed repair, HDR)(图1-1)。HDR通过以同源的DNA序列为模板来修复断裂的DNA双链,损伤的DNA序列与其互补的模板DNA严格配对。在细菌中这个修复作用是由RecA蛋白催化进行的,在真核生物中由Rad51蛋白催化完成(Sarbajna and West,2014)。同源重组一般发生在细胞的S/G2期。在没有同源序列的情况下,双链断裂就以NHEJ的方式修复。NHEJ是将DNA末端连接起来的方式来进行修复,这种机制能发生错配,很容易改变基因的序列,在损伤的位点导致碱基的小片段删除或插入。NHEJ活跃于整个细胞周期,尽管这种方式容易发生错配,但仍然是双链断裂的主要修复方式(Chiruvella et al., 2013)。NHEJ提供了一种有效的打断基因功能的途径-敲除(knock-out),而HDR通过精确复制模板,将模板上改变的遗传信息带进修复的DNA的方法则提供了另一种编辑方式-依靠同源序列的敲入(knock-in)。NHEJ和HDR是基因编辑的两种不同的重要方式,这两种方式几乎存在于所有的活的生物体中,因此,这两种打靶方法原则上能用于任何物种(Gilles and Averof, 2014)。
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1.2 人工核酸内切酶
如何找到一种特异性识别切割基因组产生DSBs的核酸酶则成为基因组编辑的难点(Epinat et al., 2003),一个重大的转机出现了,研究者意识到DNA单元识别区域通过组合可以使核酸酶靶向更广的序列范围(Kim et al., 1996)。由于锌指能够特异识别DNA双链上的连续3个核苷酸,根据这种思路,锌指核酸酶成为第一个被开发出来的人工核酸酶。第二个人工核酸酶TALEN也是基于了类似的设想。可以说ZFN和TALEN都是由FokI介导对DNA进行切割的,不同于前两代核酸酶,第三代人工核酸酶CRISPR/Cas是一种由RNA介导的基因组编辑技术,因其简便、低耗、高效而成为现在运用最广泛的基因组编辑工具酶。能使基因组位点特异性断裂的特异性核酸内切酶的出现,使研究者能对感兴趣的基因位点进行精确的操作(F.A. Ran et al., 2013b)。基因组编辑技术的发展推动基因研究领域的革新,现在研究者可以利用人工核酸酶对任何基因进行删除或整合(Gupta andShukla, 2016)。在精确性和适用性上,现代基因组编辑技术可以通过选定基因自身的序列来进行基因组修饰,比传统的转基因方法和RNAi介导的敲减技术更有优势。用人工核酸酶技术既可以对编码基因进行修饰,也可以对顺式调控元件进行操作,以此来获得或失去基因功能,能灵敏精确的反映内源基因的表达和功能。在自然的环境下实施基因操作,基因在生物学意义水平上的表达可以对顺式元件调控作用下基因的变异进行精确的研究(Gilles and Averof, 2014)。
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第二章 Rep/Don 打靶系统的构建
 
CRISPR/Cas9 核酸酶技术是一种运用 CRISPR/Cas9 对基因组进行特定位点切割,在DNA 序列内部产生一个双链断裂的切口(double-strand break, DSB),并利用 DNA 自身的损伤修复机制对基因组进行精确编辑的技术。近几年,该技术迅猛发展,广泛用于各类物种的基因组编辑。用 CRISPR/Cas9 技术实现基因组精确编辑主要是通过 HDR 机制来实现的,但在哺乳动物细胞中 HDR 并非是最主要的修复机制,且存在着效率低、阳性细胞筛选困难、纯化及阳性细胞鉴定工作量大等问题。后基因组时代,对未知新基因及已知基因新功能的探究成为当前生命科学领域研究的热点,主要的研究方法是在细胞和个体水平上进行研究。另一方面,为满足市场需求,改善畜禽的生产性能,降低生产成本,利用生物技术快速培育出抗病力强、生产性能优良并能稳定遗传的畜禽品种成为当前家畜改良工作的一个重要途径。动物细胞研究中,有两类常用的报告基因,一类是在一定范围波长的有色光的激发下能够发光,便于观察和检测的荧光蛋白表达基因;另一类是抗生素抗性基因,抗性基因表达后,能抗御对应的抗生素,抗性基因可以用于细胞的正负向筛选。报告基因既能以报告载体(Kim et al. 2011) 的方式存在,也可以整合到细胞基因组中形成可稳定遗传的报告基因细胞系(Porteus and Baltimore 2003)。报告载体既能与人工核酸酶瞬时共转细胞检测核酸酶的活性,也能整合到细胞基因组中,具有和基因组 DNA 一样稳定可遗传的特点,便于基因组编辑阳性细胞的筛选。试图构建出一套 CRISPR/Cas9 核酸酶高效等位基因打靶系统 Rep/Don,此打靶系统同时兼备报告系统功能和供体功能,便于操作且高效可行,既能对核酸酶的性能进行评估,将系统的工作效率以可见荧光的形式直观呈现,也能作为供体将外源 DNA 序列整合到细胞基因组 DNA 的特定位点。同时,经过抗生素药物筛选后形成的阳性细胞克隆在蓝/绿光的激发下,能发出可以用荧光显微镜观察到的绿色/红色荧光,有助于单克隆细胞的筛选。通过这套系统,高效获取纯合细胞系,为研究基因功能、生产转基因动物提供一种新的方法。
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2.1 试验材料
 
2.1.1 菌株、细胞系及质粒
根据《分子克隆实验指南》(第三版)上的 Inoue 方法,用大肠杆菌菌株 DH5α(购自北京全式金生物公司)制备超级感受态。LB 培养基加入氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)使其终浓度为 100 μg/mL。细胞系 HEK293T 系本实验室保存。质粒 pcDNA3.1-mRFP 购于 Addgene,RPG、pll3.7-mU6-CMV-NLS-huCAS9-NLS 和 pXL-BacII-R-L 为本实验室所有。
2.1.2 试剂
DNA 聚合酶(北京全式金生物公司);T4 DNA 连接酶和限制性内切酶(NEB 公司);琼脂糖凝胶胶回收试剂盒、细菌质粒小提试剂盒(Omega);酵母浸粉、蛋白胨、NaCl、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)、琼脂粉等实验室常用生化试剂购自宝鑫公司;胰蛋白酶购自西安沃尔森;DMEM、Antibiotic-Antimycotic(10000 units/mL 青霉素(penicillin),10000 μg/mL 链霉素(streptomycin),及 25 μg/mL 两性霉素 B(Amphotericin B))(Gibco);So-Fast 转染试剂(厦门太阳马公司);胎牛血清(ScienceCell)。
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2.2 试验方法
 
2.2.1 Rep/Don PG 载体构建
Rep/Don PG 载体包含目标基因特定位点两侧的同源序列,以及位于两条同源臂之间的 CAG 启动子、嘌呤霉素抗性基因及由 T2A 连接的与其融合表达的 eGFP 基因。其中嘌呤霉素抗性基因是被 200 bp 的 SSA 同源臂序列打断,而目的基因靶序列插在两个SSA 同源臂中间,T2A 剪切肽序列和 eGFP 基因都是移码的。取 5 μl 连接产物转化到 DH5α超级感受态中,冰上孵育 30 min,42 ℃热激 65 s,热激后立即放置冰上,在冰上放置 5 min。取出后用涂布棒均匀涂布到含有 100 μg/ml 氨苄青霉素抗性的 LB 固体培养基(LB/Amp)上,放置到培养箱 37 ℃培养 10 h~12 h。挑取单克隆并接种到 LB/Amp 液体培养基中,在摇床中 37 ℃培养 12 h。当培养浓度达到OD=1 时参照质粒提取试剂盒说明书操作步骤提取质粒并进行阳性质粒酶切鉴定,酶切鉴定正确的质粒用测序引物 pCAG-F 进行测序检测,将最终检测正确无误的阳性质粒命名为 CCR5-RPG(图 2-4)。
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第三章 Rep/Don 打靶系统的优化及其在 HEK293 细胞上的应用..........36
3.1 试验材料..........37
3.2 试验方法..........38
3.3 试验结果..........44
3.4 讨论.........60
3.5 小结.........62
第四章 Rep/Don 打靶系统靶向编辑猪 lnc-sscg3623 基因.....64
4.1 试验材料..........64
4.1.1 菌株、细胞系及质粒..........64
4.1.2 试剂...........65
4.1.3 试剂配制............65
4.1.4 主要仪器设备....65
4.1.5 引物...........65
4.2 实验方法..........66
4.3 试验结果..........74
4.4 讨论.......101
4.5 小结.......102
 
第四章 Rep/Don 打靶系统靶向编辑猪 lnc-sscg3623 基因
 
众所周知,一直以来可控和可设计的敲入大片段基因表达盒都是动物细胞工程所期望的,这项技术可以广泛的运用于动物基因功能研究、基因编辑治疗疾病、生物制药、生产转基因动物等领域(He et al., 2016; T. Sakuma et al., 2015; B. Wang et al., 2015)。设计这套打靶系统的目的旨在用于研究与动物生产相关基因的功能,甚至于生产能够改良动物生产性能的转基因家畜。通过前面两章的研究,我们设计构建了一套有效的 Rep/Don打靶系统,已经分别在载体水平和哺乳动物细胞基因组水平上进行了试验,证实了CRISPR/Cas9 核酸酶具有良好活性,Rep/Don 打靶系统在载体和细胞基因组上都能正常的工作,能在哺乳动物细胞基因组上通过定点敲入外源基因进行基因组编辑,帮助我们高效的获得双敲的细胞。前面进行的是编码蛋白基因的定点敲入研究,接下来用Rep/Don打靶系统对猪的非编码基因进行靶向定点编辑研究。生猪养殖是我国畜牧业一个重要的组成部分,我国肉食品消费主要是猪肉,而消费者的需求、生猪养殖效率、健康养殖或避免疾病对猪的影响都是养猪生产过程中考虑的重要因素,所以作为猪生产中重要经济性状的猪肉品质、生长发育、猪繁殖以及抗病能力一直以来都是猪遗传育种的研究重点和热点。由于猪的体型、器官脏器大小与人类似,近年来猪在医学上作为人类疾病模型和器官供体的研究也非常热门。生物体基因数目的很大部分是非编码基因,其数量远超过编码基因,由于其与生长发育、进化和疾病发生等的相关性而受到广泛的关注。特别是一些长度超过 200 个核苷酸的长链非编码的RNA(lncRNA),在表观遗传调控、转录水平及转录后水平等多个层次调控基因的表达,在诸如细胞生长、胚胎发育、基因组印迹、X 染色体沉默、脂肪代谢调控、疾病发生等复杂的生命进程中发挥重要作用。lncRNA 的保守性较低,大部分 lncRNA 具有明显的组织细胞特异性和时空表达特异性(Ulitsky and Bartel, 2013)。有研究表明,在猪生长发育的不同时期其背膘中 lnc-sscg3623 基因与脂肪沉积能力呈负相关,表现出不同的甲基化水平及去甲基化和复甲基化现象(Z. Y. Zhou et al., 2015)。选择猪 lnc-sscg3623 基因作为敲入研究的靶基因,主要是用来检验 Rep/Don 打靶系统在猪细胞基因组非编码 RNA上的工作效率,证实这套系统可以用于不同物种、不同细胞的编码基因和非编码基因的基因组编辑,证明这套系统有广泛的适用性,可以应用到研究不同动物品种及不同类型的细胞;另一方面是为研究动物基因功能,进一步为家畜生产性能的遗传改良提供技术基础。
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结论
 
本研究在哺乳动物细胞水平建立了一套高效的 CRISPR/Cas9 人工核酸酶介导的Rep/Don 打靶系统,Rep/Don 打靶系统既可以作为报告系统反应核酸酶的活性和外源基因的整合效率也可以作为供体给细胞基因组 DNA 修复提供模板。通过这套打靶系统在HEK293T 细胞和猪 PK15 细胞上都得到了较高效率的双等位基因编辑细胞。具体结论如下:(1)在哺乳动物细胞水平建立了一套高效的 CRISPR/Cas9 介导的 Rep/Don 打靶系统;(2)在 CCR5 基因位点上,Rep/Don PG+ZR 系统得到双等位基因编辑的阳性细胞效率 34.09%;(3)在猪 PK15 细胞 lnc-sscg3623 基因 Tar2 位点,Rep/Don PG+NR 和 Rep/DonPG+ZR 系统双敲率分别为:16.67%和 18.18%。
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参考文献(略)
(责任编辑:工程论文)
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